à la recherche des peupliers noirs perdus

27 10 2011

2017

Réception du thermocycleur acquis en PPE. Retour prévu de l’appareil prêté par Science à l’École pour le bonheur de nouveaux arrivants sur le projet .

2016

Les PCR sur les ADN de pommier ne révèlent pas d’amplicon sur l’électrophorèse. Lecture difficile et douteuse.

Manque d’échantillons de l’INRA pour tenter des variations de protocole.

Affaire en attente…

Des amplicons de P.nigra à envoyer…

2015.

Découverte de nouveaux individus Populus nigra sur les berges Est de l’Allan en amont du site étudié en 2011-2014 ( prélèvements effectués).

Possible découverte d’autres individus sur l’Allaine à proximité de Delle ( prélèvements à faire).

Pommiers: nouveau contact avec  l’INRA d’ANGERS en Mai. Des échantillons apportés par les élèves en suppléments des échantillons du verger conservatoire de Faverois . Nouvelles extractions d’ADN réussies grâce aux conseils de M.Durel de l’INRA d’ANGERS.

Protocole PCR à valider en septembre 2015.

2014

Préparation du projet propre : variétés anciennes de pommiers .

Premières extractions ( prof et élèves ). Résultats : concentrations faibles.

Poursuite du projet Populus nigra : demande de 10 boutures à l’INRA pour participer à l’effort de séquençage au niveau national de génome à l’école suite à la coupe des peupliers de notre site d’étude.

Fevrier : réception de 20 boutures en provenance de la Seine. Mise en culture.

Mars : prélèvement et extraction d’ADN avec les lycées puis avec les collégiens volontaires des collèges Mozart et Aubrac.

Avril : quantification des extraits obtenus par mesure spectrophotométrique et électrophorèse révélée au Sybr’Safe par les élèves de STL biotechnologies volontaires dans le cadre de l’Aide Personnalisée ( approfondissement).

Validation des extraits.

Prévision de l’achat d’un thermocycleur en PPE (2016).

OCTOBRE 2013

Suivi phénologique du jaunissement et de la chute des feuilles.

Sortie avec 14 élèves de troisième du collège Mozart.

Rq: phénomènes bien plus tardifs qu’en 2012 ( presque 1 mois !).

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La diversité est moyenne , moins marquée que pour la floraison et débourrement.

Tous les peupliers noirs sont marqués d’un point de peinture orange . Signification ? Coupe prévue ou repérage pour ne pas couper ?

Des prélèvements ont été faits par les collégiens ainsi que des mesures de circonférence ( à comparer à la sortie de 26 janvier 2012).

Le marquage de plusieurs arbres a été  changé par les étiquettes fournies par Marc Villar car celles posées en 2012 étaient avalées par la croissance.

Surprise au retour !

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De nouveaux relevés sont nécessaires pour la chute des feuilles ( pendant les vacances ).

NOVEMBRE 2013

 MISÈRE !

Nouveau passage pour les relevés phénologiques en Novembre: mauvaise surprise, tous les peupliers noirs de la station du pied des gouttes ont été coupés.

Après tant de recherches de cet arbre dans le nord Franche-Comté, tant de soulagement d’en avoir trouvé, après les avoir sauvé de la tronçonneuse in extremis en 2012…

Marc Villar devait être prévenu avant tout abattage. Je crains que cela n’ait pas été le cas.

Et moi je reste assis les poumons dans la sciure
A filer mes temps morts à la mélancolie.
Soleil, soleil,
N’est ce pas merveilleux de se sentir piégé ?

Les amateurs reconnaîtrons la citation. Tant pis pour les autres qui ne savent pas ce qu’ils perdent.

Donc nous revoilà reparti vers d’autres aventures  à la recherche du fabuleux peuplier noir… que la force soit avec nous !

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Rappel des étapes précédentes :

de fin Juin à fin Décembre 2011:

après 6 mois de promenades le nez en l’ai, le bilan est dur :

154 L de gasoil, un pneu VTT, quelques accidents évités de justesse, une équipe pédagogique qui s’enfonce dans le doute, des élèves que l’on espère ne pas voir s’enfoncer dans les berges inondées etc etc ….

et  tout ça pour quelques peupliers repérés , photographiés. D’après les photos consultées par le pilote du programme :  tout est douteux (plutôt des hybrides) sauf un site qui semble prometteur.

10,11 et 12 Janvier : accueil de monsieur Marc Villar, responsable du programme Populus nigra (INRA Orléans). Des doutes seront enfin levés demain !

Mardi 10 :

visite de quelques sites repérés:

Bourogne (rive droite de la Bourbeuse) ; verdict : ce sont des hybrides…mais utilisables comme exemple in situ

 

( photographies prises mi-Novembre; remarquer; les fûts trop droits, les feuilles trop grandes, les bourgeons foliaires trop effilés)

Morvillars : idem

Montbéliard ( rive gauche Allan) :gagné ! Comme pressenti d’après les photos, ce sont bien des peupliers noirs ! Marc Villar et moi prélèvons huit individus pour l’INRA.

(photos prises mi-octobre )

Mardi 10 janvier 17h : rencontre au lycée avec les élèves de première STL Biotechnologies

Trop rapide…

Mercredi 11 Janvier: prospection des rives du Doubs de St Hypolite à Baume les Dames

Bilan de la journée: Un seul peuplier prélevé derrière une ZAC à Bart ( 2 peupliers présents)

J’abandonne Marc Villar qui poursuivra  la matinée du lendemain vers Baume…. bonne chance !

BILAN au 11 janvier 2012 :

Une quinzaine d’arbres identifiés le long de la véloroute dont neuf prélevés pour Guéméné ( un prélevé pour le lycée également).

La suite :

il nous faut 20 peupliers pour l’étude ! Encore un effort ! Premières sorties récolte de branches dans les jours et semaines qui viennent .

Quelques jours plus tard en retournant sur le site je vois des panneaux indiquant de l’élagage le long de la véloroute en cours à environ 2 km des peupliers.

Recherche des services d’entretien,des responsables… de nombreux appels téléphoniques pour finalement apprendre que les peupliers sont sur une programmation de coupe qui doit être finalisée en réunion le lendemain !

URGENCE !

Intervention de ma part appuyée ensuite par Marc Villar.

Nous avons eu des oreilles attentives ! Nous  espérons avoir un peu de temps devant nous pour continuer l’étude de ces seuls peupliers noirs trouvés en 6 mois ! Si les racines posent réellement un problème de sécurité pour la véloroute nous tenterons une opération sauvegarde. Nous pouvons apparemment compter sur la compréhension , voire la participation des décideurs locaux ( ONF, VNF, CG 25).

Jeudi 26 Janvier 2012: PREMIÈRE SORTIE TERRAIN DE COLLECTE D’ÉCHANTILLONS

opération prélèvement de branches le long de l’Allan avec les collégiens volontaires du COLLÈGE MOZART  accompagnés de leurs enseignants Anne Bailly et Stéphane Meshkat et les élèves de la classe de première STL Biotech.

Le site comporte plus de 20 peupliers noirs ( la nuit nous avait interrompu lors de la campagne avec Marc Villar nous empêchant de les voir tous).

Deux arbres par binôme : photographie, mesure de diamètre à 1.30m de hauteur , marquage .

Les branches prélevées sont mises dans l’eau au lycée et au collège.

27 Janvier : premières floraisons !

Début Février : premières feuilles timides…

Mercredi 8 Février : travail de l’équipe pédagogique pour validation de l’extraction de l’ADN à partir de feuilles ( quelques feuilles congelées du mois d’octobre et d’autres prélevées sur les forçages).

Contrôle par l’absorbance à 280 nm assez satisfaisant.

La technique et les réactifs sont validés.

Lundi 20 Février 2012 :  SORTIE TERRAIN COLLÈGE LUCIE AUBRAC A BOUROGNE.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Opération de prélèvement suivie d’une séance de mise en fiche de chaque arbre avec son identification, ses photos et sa localisation exacte en utilisant GoogleEarth. En attendant le débourrement des feuilles prévu à la rentrée grâce au forçage. Ci dessous : une branche femelle prélevée le 26 Janvier, aujourd’hui débourrée et porteuse de fruits.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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Malheureusement, les forçages n’ont pas donné ce qui était prévu. Beaucoup de branches ont séché et d’autres ont été ravagées par des insectes…

Il faudra retourner prélever la plupart des individus.

Mars

9 Mars: une sortie personnelle vers Bart pour finir les vacances pour vérifier en amont du site vu avec Marc Villar.

Je découvre enfin un Populus nigra comme je m’étais résigné à ne ne jamais en voir dans le nord Franche Comté !

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Voila …. DOB#42 ….

Mercredi 14 Mars : PCR 1 manipulation professeurs au lycée essais validation PCR électrophorèse : résultat OK1

L’ensemble des techniques sont validées : le travail peut commencer avec les élèves.

Jeudi 15 première séance extraction ADN par les élèves de première STL Biotechnologies.

Vendredi 16 accueil  »démonstration » pour Marie Claude Lepera du collège Lucie Aubrac.

Jeudi 22 : première séance PCR2  avec les élèves de première STL Biotechnologies. Résultats décevants. Beaucoup de négatifs.

Contrôle fait en PCR3 , différents problèmes sont mis en évidence: certains extraits sont de mauvaise qualité, certaines PCR ont été mal réalisées. Le métier rentre !

Jeudi 29: Enchaînement extraction et PCR 4 par les élèves de première STL Biotechnologies. En faisant abstraction des erreurs de dépôts les résultats sont satisfaisants.

Jeudi 29 : accueil  »démonstration » collègues du collège Mozart : Anne Bailly et Stéphane Meshkat.

Jeudi 5 Avril: TP Collège Mozart . Chaque lycéen encadre 2 collégiens.

En parallèle PCR 5 pour tester des amorces à Tm plus élevée (FRI 02 et CRY03) mais en conservant le programme de thermocycleur à 55°C. Résultats variables et souvent faibles.

Jeudi 12 Avril : TP collège Aubrac. Démonstration PCR 6 et réalisation d’une électrophorèse de contrôle sur amplicons produits précédemment. Merci à Anne Bailly pour sa participation à la préparation des réactifs !

PCR 6 identique à PCR 5 mais hybridation à 57 ° C . Résultats satisfaisants.

MAI

7 Mai: PCR 7 ( compléments CAD et CRY 02 sur ADN encore non amplifiés) Quelques résultats montrent une amplification non spécifique. ( 5 sur 16 ; 7 sur 16 non amplifiées ).

9 Mai : PCR 8 compléments CAD ; résultats satisfaisants (-5 échecs sur 14)

10 Mai : PCR 9 PHYB2 : très bons résultats ( 2échecs sur 16 ).

15 Mai :PCR 10 grande série avec CRY2, FRI01, FRI03 à 55.5 °C . Beaucoup d’amplifications non spécifiques parasitent les résultats. Sans doute une température trop optimiste. 48 PCR dont 10 négatives et plus de 30 avec traces d’amplifications non spécifiques….mauvais jour !

22 Mai : PCR 11 Compléments CAD et PHYB2 ( 1 échec sur 12, certains un peu faibles).

24 Mai : PCR 12 recherche de pollution dans la DeamTaq Mix et dans l’eau : résultats négatifs. élimination de cette hypothèse dans l’apparition des traces non spécifiques.

25 MAi : PCR 13 introduction de nouvelles amorces SOC, COLet GI avec CRY2 en témoin ( 57°C). Résultats 4/5 pour CRY2 ; entièrement négatif pour SOC, COL et GI ( 5 ADN différents). Encore un mauvais jour !

JUIN

5 Juin PCR 14 : nouveaux tests sur CRY2 SOC COL et GI avec 3 autres extraits d’ADN : résultat négatif pour SOC COL et GI ! Amorces à problème ! En CRY2 à nouveau une trace d’amplification non spécifique…

12 Juin PCR 15 : nouveau contrôle sur SOC et GI et une nouvelle amorce PHYA avec en témoin CRY2 : double trace partout d’amplification non spécifique.( révélation le 21 Juin)

Comment l’expliquer ?Deux fragments présents quelque soit l’amorce !Ils mesurent moins de 250 pb.

22 Juin : recherche de modifications du protocole pour éliminer les amplifications non spécifiques.

Juillet 2012 : envoi des amplicons au centre national de séquençage.

Automne 2012 : début des analyses de séquence.

 

2013

Stage exploitation des séquençages à l’école de l’ADN à Nimes.

Content de retrouver les compagnons du peuplier et autres fondus de la PCR.

Confirmation : les peupliers de Montbéliards sont purs !

Poursuite du travail d’extraction et amplification avec les élèves de première STL Biotechnologies et une soixantaine d’élèves des collèges Aubrac et Mozart.